Reprogramação metabólica in vitro potencializa a sinergia entre linfócitos B-1 e macrófagos e aumenta a viabilidade celular

Resumo

A Diabetes mellitus (DM) é uma doença metabólica crônica responsável por milhões de mortes anualmente e, apesar de existir tratamento, permanece ainda sem cura, incentivando diversos estudos, especialmente no âmbito das terapias celulares. A partir da descoberta de que linfócitos B-1 são capazes de produzir insulina e regular a glicemia de camundongos diabéticos, nosso grupo de pesquisa busca meios de viabilizar uma terapia celular a partir dessas células. Dentre os desafios encontrados está a necessidade de co-cultivar os linfócitos B-1 com macrófagos para sua sobrevivência. Inicialmente, estudos mostraram que a IL-6 era responsável por essa dependência, porém temos observado maior sobrevivência de linfócitos B-1 submetidos ao protocolo de reprogramação metabólica (RM) para diferenciação em células produtoras de insulina, mas ainda dependente da presença de macrófagos. Deste modo, no presente trabalho buscamos compreender a influência do protocolo para RM na produção de citocinas e no metabolismo de glicose por macrófagos em culturas de células peritoneais aderentes. Para tanto, foi cultivada a porção aderente de células do lavado peritoneal e, as culturas, submetidas à RM, a partir do cultivo das células em meio suplementado com crotoxina, altas concentrações de glicose e nicotinamida. Após, foram avaliados os macrófagos em relação à captação e metabolismo da glicose, expressão de genes relacionados ao metabolismo da glicose e produção de citocinas, além da quantificação de citocinas no sobrenadante das culturas. Os achados revelaram que nos momentos iniciais da cultura, quando as células foram tratadas com glicose e crotoxina, foi observado ao longo de 72 horas, aumento das citocinas IL-12 e IFN-γ mas também IL-10. Em comparação com o controle, os níveis de TNF-α, MCP-1 e IL-6 estavam mais baixos. Aos 6 dias, sem crotoxina, com nicotinamida e 30mM de glicose, também foi observado menores níveis de IL-6 e TNF-α. Já a expressão genética relativa demonstrou cerca de 3x mais expressão de IL-6 no grupo do protocolo que no controle. Não houve diferença na expressão dos genes sinalizadores da via de produção de citocinas, o MyD88 e o NF𝜿B. A tendência ao aumento da expressão gênica de IL-6 associado aos níveis diminuídos dessa citocina nas culturas, nos fez investigar em linfócitos B-1 a expressão dos genes associados ao consumo dessa citocina. No grupo submetido ao protocolo houve tendência à maior expressão do receptor de IL-6 e STAT3. Ainda, houve aumento da viabilidade e diminuição da apoptose em macrófagos presentes no co-cultivo quando submetidos à RM. Embora a captação de glicose pareceu estar diminuída, assim como a expressão de Glut-1, a atividade máxima das enzimas associadas à glicólise aumentou após o protocolo, enquanto foi observada uma tendência à diminuição da atividade enzimática associada à via das pentoses. Também, todos os genes avaliados associados à via glicolítica ou lipolítica estavam modulados negativamente nos macrófagos reprogramados. Em conclusão, o protocolo de RM direcionado à produção de insulina por linfócitos B-1 afeta também o metabolismo e o perfil inflamatório dos macrófagos, também presentes na cultura, revelando características de macrófagos M2, mais anti-inflamatório. No entanto, a expressão gênica contrapõe esses achados. A expressão diminuída de Glut-1 corrobora com a menor captação de glicose observada, embora a atividade máxima enzimática sugere aumento da via glicolítica clássica. Os resultados, em qualquer momento avaliado, indicam maior produção de IL-6 por macrófagos reprogramados metabolicamente e provável consumo dessa citocina por linfócitos B-1. Em conjunto, esses resultados auxiliam na compreensão da sinergia entre macrófagos e linfócitos B-1 e reforçam a importância da IL-6 para a sobrevivência do linfócito, fato que auxiliará os estudos que visam o estabelecimento da terapia celular para o controle da DM a partir de linfócitos B-1.