Caracterização Fenotípica e Genotípica de Malassezia spp. Isoladas de Conduto Auditivo Externo de Equinos

Resumo

O presente estudo teve como objetivo identificar espécies do gênero Malassezia isoladas do conduto auditivo externo de equinos, através de provas fenotípicas e genotípicas. Foram utilizados 55 animais sadios, 39 (70,9%) machos e 16 (29,1%) fêmeas, de diferentes raças e idade adulta, os quais foram contidos fisicamente. Após limpeza do pavilhão auricular, foi colhido cerúmen de cada conduto, pela introdução de um swab estéril. As amostras clínicas (107, pois 03 delas foram descartadas, devido contaminação) foram enviadas ao Laboratório de Biologia Molecular e Celular da Universidade Paulista (UNIP), onde foram semeadas em placas contendo meio de Dixon modificado, as quais permaneceram incubadas a 32°C por até duas semanas, a fim de se detectar o crescimento de colônias. As colônias isoladas foram estudadas macro e micromorfologicamente, para se confirmar a morfologia característica do gênero. A identificação fenotípica em espécies foi baseada em aspectos fisiológicos da levedura, verificando seu comportamento frente a diferentes fontes de lipídios, sendo empregados Tween 20, 40, 60 e 80, e cremophor-EL, testando-se ainda, produção da enzima catalase e degradação de esculina. Malassezia sp foi isolada em 33/55 (60,0%) dos animais e em 52/107 (48,6%) dos condutos. Nos testes fenotípicos, nenhuma das cepas cresceu em ágar Sabouraud dextrose, sendo, portanto, lipodependentes. Todas as cepas produziram a enzima catalase e degradaram esculina. Verificou-se assimilação de Tween 20, 40, 60 e 80, ausência de assimilação de cremophor-EL em 37/52 (71,2%) das cepas isoladas; as outras 15 cepas apresentaram diferentes padrões de leitura, entretanto, nenhum dos resultados obtidos possibilitou caracterização fenotípica em espécie. Após extração do DNA, através de fervura durante 10 minutos, as amostras foram submetidas à técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) e, posteriormente, à técnica de RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) nos produtos obtidos da PCR, utilizando-se as enzimas de restrição BstCI e HhaI, caracterizando-se molecularmente M. nana 42/52 (80,8%) e M. slooffiae 10/52 (19,2%). Duas cepas de cada uma das espécies foram encaminhadas para sequenciamento genético. A análise do sequenciamento da região dos genes 26S rRNA D1/D2 e ITS1-5.8S-ITS2 rRNA das quatro cepas analisadas confirmou, molecularmente, duas cepas como sendo M. nana e as outras duas como M. slooffiae. Neste estudo, M. nana foi a principal espécie do gênero Malassezia encontrada em conduto auditivo externo de equinos, representando mais de 80% das cepas, não se isolando M. equina, como seria esperado. Portanto, novos levantamentos epidemiológicos devem ser realizados em diferentes regiões, a fim de se confirmar este achado. Conclui-se que a caracterização genética é imprescindível em estudos com amostras clínicas provenientes de equinos e evidencia-se a necessidade de se ampliar pesquisas que possibilitem maior compreensão do encontro dessas leveduras lipodependentes, e as espécies constituintes da microbiota, uma vez que, em outras espécies animais, já está demonstrado que Malassezia spp. podem se constituir em importantes agentes etiológicos de infecções micóticas.