Caracterização do cultivo de Células Cutâneas em Monocamada e sobre Scaffold Colagênico para o Estudo de Infecções Fúngicas Zoonóticas

Resumo

A abordagem One Health é um método eficaz para o gerenciamento de doenças zoonóticas em humanos, animais e ambientes. No caso de zoonoses cutâneas, a pele desempenha um papel central e pode atuar como uma barreira de proteção contra patógenos ou se tornar um importante meio de transmissão. Neste contexto, este estudo teve como objetivo estabelecer um modelo experimental baseado no cultivo de células cutâneas para investigar infecções fúngicas zoonóticas. Métodos: Para isso, linhagens de queratinócitos humanos (HaCaT) e fibroblastos gengivais (FGH) foram cultivadas separadamente e cocultivadas em monocamada e sobre substrato colagênico e então expostas aos patógenos Criptococcus gattii (C. gattii) e Encephalitozoon cuniculi (E. cuniculi) (MOI 2:1, 4:1 e 8:1) por 48 horas e 7 dias. Em seguida, a viabilidade celular foi determinada pela redução do MTT e os parâmetros histopatológicos e a concentração de citocinas foram analisados. Os resultados mostraram que, para os fibroblastos, ambas as infecções promoveram aumento da atividade metabólica tanto em 48 h quanto em 7 dias em todas as concentrações. Diferentemente, no HaCaT exposto ao C. gattii ocorreu diminuição da atividade metabólica apenas na concentração 2:1 em 48 horas e diminuição após 7 dias em todas as concentrações. Para cocultura, a infecção aumentou a atividade metabólica em 48 horas e reduziu em 7 dias. Adicionalmente, a citometria de fluxo com Anexina e 7-AAD foi utilizada para avaliar o tipo de morte celular. Nos FGH expostos a E. cuniculi, observou-se uma inibição da necrose primária e um aumento da apoptose programada, possivelmente favorecendo a sobrevivência do microrganismo por meio de um mecanismo sofisticado de evasão imune, permitindo sua replicação sem desencadear uma resposta inflamatória intensa. No co-cultivo, entretanto, E. cuniculi apresentou um comportamento distinto: a porcentagem de células viáveis não diferiu significativamente do controle, mas houve um aumento na apoptose tardia e na necrose. Diferente do que foi observado em FGH isolados, o microrganismo apresentou menor taxa de apoptose, sugerindo que, em um ambiente mais fisiológico, sua interação com as células ocorre de maneira diferenciada. Já na infecção por C. gattii, verificou-se um aumento na viabilidade celular tanto nos FGH isolados quanto no co-cultivo, com baixa taxa de apoptose, apoptose tardia e necrose no co-cultivo. Esse achado sugere que o microrganismo emprega mecanismos para prolongar a viabilidade celular, favorecendo sua multiplicação e sobrevivência. A coloração com HE e Giemsa confirmou a presença de microrganismos no espaço intracelular apenas para o E. cuniculi, evidenciando sua característica de parasita intracelular obrigatório. Na avaliação das citocinas, a infecção por C. gattii em células cultivadas em monocamada induziu uma resposta pró-inflamatória, acompanhada por uma resposta reguladora simultânea e imunossupressão, caracterizada pela redução das concentrações de IL-8, IL-6 e IL-10 na infecção por E. cuniculi. Por outro lado, no co-cultivo em substrato colagênico, a infecção por C. gattii induziu uma resposta inflamatória, enquanto a presença de Condroitin Sulfato demonstrou um possível efeito anti-inflamatório. Nossos resultados validam a aplicação do cultivo de células cutâneas como uma ferramenta eficaz para investigar as características imunológicas e citotóxicas das infecções zoonóticas cutâneas. Contudo, a análise conjunta dos resultados fundamenta a utilização preferencial do substrato colagênico enriquecido pelo C.S. para o estudo de patógenos intracelulares obrigatórios.