Imortalização de células mesenquimais do ligamento periodontal com fenótipo osteogênico de baixa produção mineral

Resumo

As células-tronco mesenquimais oriundas do ligamento periodontal (PDLCs) constituem uma fonte celular acessível e com potencial multipotente, sendo amplamente estudadas em estratégias terapêuticas regenerativas. No entanto, sua heterogeneidade fenotípica, especialmente nas subpopulações com reduzida capacidade de mineralização (l-PDLCs), compromete a previsibilidade dos resultados clínicos. Além disso, a limitação replicativa das
células primárias dificulta a condução de experimentos prolongados in vitro. Visando contornar esses entraves, foi desenvolvida uma linhagem imortalizada de l-PDLCs (il-PDLCs) por meio da inserção do gene da transcriptase reversa da telomerase humana (hTERT) via vetor lentiviral, seguindo-se da caracterização fenotípica e molecular comparativa entre as il- PDLCs e as células primárias. A análise dos marcadores de superfície (CD105, CD166 e CD34) foi feita por citometria de fluxo. A expressão dos genes hTERT, OCT4 e NANOG foi quantificada por PCR em tempo real (qPCR), assim como a de genes relacionados à osteogênese (RUNX2, SP7, ALPL) e à proliferação celular (MAPK14, YAP1 e CREB1), analisados nos dias 3, 7 e 10 após indução osteogênica. A atividade da enzima fosfatase alcalina (ALPL) e a coloração por Alizarina Vermelha foram utilizadas para avaliar o potencial de mineralização nos dias 14, 21 e 28, sendo que a atividade enzimática foi quantificada apenas no dia 14. As il-PDLCs apresentaram aumento expressivo na expressão de hTERT (2.300 vezes), mantiveram o perfil mesenquimal (positividade para CD105/CD166 e ausência de CD34) e exibiram níveis elevados dos marcadores de pluripotência OCT4 e NANOG, em comparação às l-PDLCs (p ≤ 0,05). Após a indução osteogênica, genes associados à proliferação celular (MAPK14, YAP1 e CREB1) mostraram-se regulados positivamente nas il- PDLCs, que também apresentaram expressão antecipada e intensificada de RUNX2, SP7 e ALPL, com picos no dia 7 (aproximadamente 200 vezes para RUNX2 e SP7 e 100 vezes para ALPL), quando comparadas às l-PDLCs (p ≤ 0,05). Observou-se ainda correlação positiva significativa entre YAP1 e os marcadores osteogênicos RUNX2 e SP7, especialmente nos dias 7 e 10. Apesar dessa vantagem molecular inicial observada nas il-PDLCs, a deposição mineral foi mais progressiva nas l-PDLCs, atingindo seu pico no dia 28 (p ≤ 0,05 em relação às il-PDLCs). A atividade enzimática da ALPL reforçou o padrão global de baixa mineralização nas duas populações celulares. Em conjunto, os achados indicam que as il-PDLCs conservam o fenótipo de baixa capacidade de mineralização característico de suas células originais primárias, ao mesmo tempo em que oferecem um modelo estável para estudos sobre o baixo potencial osteogênico em células-tronco mesenquimais.