Caracterização fenotípica e genotípica de Malassezia spp. isoladas de conduto auditivo externo de cães com e sem otite

Anexos

Informações

Título

Caracterização fenotípica e genotípica de Malassezia spp. isoladas de conduto auditivo externo de cães com e sem otite

Autor(es)

Graziela Habib Nardi

Orientador(es)

Selene Dall'Acqua Coutinho

Data de Defesa

03/04/2009

Resumo

Malassezia pachydermatis é um agente etiológico oportunista não lipodependente frequentemente associado a otites e dermatites caninas. Entretanto, nos últimos anos, espécies lipodependentes também têm sido isoladas de animais. O objetivo do presente estudo foi investigar a presença de espécies do gênero Malassezia em conduto auditivo externo de 25 cães sadios e de 25 com otite (52 condutos auditivos sadios e 48 com infecção), perfazendo 100 amostras clínicas. As amostras foram obtidas pela introdução de swab estéril no conduto auditivo, após limpeza com solução de álcool-éter. Os swabs foram semeados em placas contendo meio de ágar Sabouraud dextrose modificado, incubadas a 35ºC por duas semanas. Os isolados foram estudados por meio da macro e micromorfologia e identificados fenotipicamente pelas provas de catalase, degradação de esculina, crescimento ante a Tween 20, 40, 60 e 80 e Cremophor-EL. Pesquisou-se ainda a produção das enzimas fosfolipase e proteinase, possíveis fatores de virulência da levedura. Isolou-se Malassezia spp. em 18/25 (72%) dos cães sadios e 19/25 (76%) daqueles com otite, correspondendo a 28/52 (54%) e 33/48 (69%) respectivamente, de condutos sãos e com infecção; houveram animais dos quais se isolou mais de uma cepa por conduto. M. pachydermatis foi a espécie mais frequente, sendo isolada em 100% (30/30) e 89% (31/35) de cepas isoladas, respectivamente, de cerúmen e secreção ótica; cepas de M. pachydermatis lipodependentes foram isoladas em três cães com infecção (3/19 – 16%) e de quatro condutos destes (4/35 – 11%); essas cepas haviam sido identificadas fenotipicamente com M. furfur. Todas as cepas foram caracterizadas por meio das técnicas de Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) e Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) como M. pachydermatis, apresentando 94% de concordância com as técnicas fenotípicas; entretanto, as cepas lipodependentes apresentaram diversidade genética em relação às não lipodependentes pela técnica de PFGE. Proteinase foi produzida por 24/30 (80%) para isolados provenientes de cães sadios e 29/35 (83%) para os de infecção, enquanto, para fosfolipase, 19/30 (63%) e 20/35 (57%) foram obtidos, respectivamente, dos isolados de cães sadios e com infecção. Conclui-se que os métodos fenotípicos de identificação são aceitáveis para a rotina laboratorial; porém, se os laboratórios veterinários não incluírem em sua metodologia meios de cultivo acrescidos de lipídeos, ocorrerão resultados falso-negativos.

Resumo (EN)

Malassezia pachydermatis is an aetiological agent of superficial mycosis in dogs and cats, causing otitis and dermatitis. Since M. pachydermatis is the only non­lipodependent species, veterinary laboratories usually employ mycological culture medium without lipids to isolate this microrganism. Nevertheless, lipodependent Malassezia species have been isolated from both healthy and diseased animals. This study s objective was to determine the presence of lipo-and-non-lipodependent Malassezia species in the external ear canal of dogs with and without otitis, characterizing strains using phenotypic and genotypic techniques. Fifty dogs were studied, 25 with and 25 without otitis. A total of 100 samples were studied - 48 of otic secretion and 52 of cerumen originated from the ear canal with and without infection, respectively. Samples were cultured on Sabouraud dextrose agar supplemented with glycerol and olive oil. The isolates were characterized phenotypically by means of macro-and micromorphology, catalase tests, esculin degradation and growth on Tween 20, 40, 60 and 80, and Cremophor-EL. Cariotyping was performed via Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) and Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP). This study researched also phospholipase and proteinase enzymes production as a possible virulence factors of the yeast. Malassezia spp. were isolated from 18/25 (72%) and 19/25 (76%) dogs without and with otitis, respectively. Malassezia spp. were isolated respectively from 28/52 (54%) and 33/48 (69%) of the cerumen and otic secretion samples; more than over strain was isolated from some samples. M. pachydermatis was the most prevalent species, having been isolated from 100% (30/30) and 89% (31/35) of the strains originated from cerumen and otic secretion. Four lipodependent strains (4/35 11%) were isolated from 3/19 (16%) animals with otitis, and characterized phenotypically as M. furfur. Through both genetic molecular methods employed in this research, all strains were identified as M. pachydermatis. Therefore, the 4 strains identified as M. furfur by phenotypical methods really were lipodependent M. pachydermatis. Concordance between phenotypical and genotypical techniques was 94%. Concerning proteinase, 29/35 (83%) and 24/30 (80%) strains produced that enzyme from dogs with and without otitis, respectively. Phospholipase was produced by 20/35 (57%) and 19/30 (63%) of strains from dogs with and without otitis, respectively. lt concludes that phenotypic methods permit a satisfactory identification scheme for Malassezia spp., but if commercial veterinary laboratories do not use media with the addition of lipids for isolation of these yeasts, it might yield false-negative results in veterinary clinical samples, and probably therapeutic unsuccess.

Tipo

Dissertação

Palavras-chave

Malassezia spp, M, pachydermatis, Otite, Microbiota, Cães, Tipagem Molecular, PFGE, PCR-RFLP, Exoenzimas

Grupo de Pesquisa da UNIP cadastrado no CNPq

Clininfec - Clínica e doenças infecciosas veterinárias

Instituição

UNIP

Direito de Acesso

Acesso Aberto